Выявление мутаций в гене транстиретина (TTR) у больных с кардиомиопатиями

В последнее время большой интерес представляют так называемые «конформационные» заболевания, при которых происходят изменения пространственной организации белковых молекул. К этим заболеваниям, в первую очередь, относятся амилоидозы. В основе амилоидозов лежит способность некоторых белков формировать особые надмолекулярные агрегаты - фибриллы. Накапливаясь в различных тканях и органах, белковые фибриллы приводят к образованию амилоидных отложений [1].
К амилоидозам относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кардиомиопатии, старческие системные амилоидозы и многие другие. В настоящее время известно около 30 белков человека, которые вызывают амилоидозы.
Кардиомиопатия – это достаточно распространенное тяжелое заболевание, при котором поражается миокард. Существуют разные причины развития этой болезни, одной из них является амилоидоз. Формирование амилоидных отложений происходит во внеклеточном матриксе и около малых сосудов, расположенных в толще миокарда [2].
Транстиретин является одним из амилоидогенных белков, фибриллы которых можно обнаружить при кардиомиопатиях, полинейропатиях и системных амилоидозах. Уже найдено около 100 мутаций гена этого белка в различных странах [3].
Исследуя спектр мутаций гена TTR, в дальнейшем можно разработать методы быстрого выявления наиболее распространенных в данном регионе мутаций. Подобные исследования осуществлялись в Португалии, Японии, Швеции и других странах, однако, в России такие исследования практически не проводились.
В настоящее время эффективных способов лечения транстиретиновых амилоидозов не существует, как и не существует быстрых методов диагностики.
Выявление мутаций можно проводить, используя стандартные методики: анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP-анализ) и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).
Результаты поиска мутаций в гене транстиретина у больных с кардиомиопатиями могут быть использованы для создания методов точной и ранней диагностики этого заболевания.
Исследование причин фибриллогенеза является перспективной задачей, так как изучение этих причин позволит разработать безопасные для человека пути ингибирования амилоидогенеза, а также способы профилактики и лечения этих заболеваний. Поиск мутаций в гене TTR даст возможность выявить наиболее распространенные в данном регионе мутации, и определить риск развития заболевания у родственников пациентов, носителей мутации.

Введение 6
1 Аналитический обзор 8
1.1 Транстиретин 8
1.1.1Строение и функции ТТR 8
1.1.2 Роль мутаций гена ТТR в образовании амилоидов 11
1.2 Амилоидоз 16
1.2.1 Представления об амилоидозах 16
1.2.2 Структура амилоида и фибрилл 20
1.2.3 Механизм образования амилоидных фибрилл 23
1.3 Общие сведения о кардиомиопатии 25
1.4 Методы выявления мутаций 27
2 Патентный поиск 33
3 Цель и задачи работы 35 4 Экспериментальная часть 36
4.1 Материалы исследования 36
4.1.1 Реактивы 36
4.1.2 Лабораторное оборудование 37
4.2 Методы исследования 39
4.2.1 Стандартные растворы 39
4.2.2 Выделение ДНК из замороженной крови 39
4.2.3 Электрофоретическое разделение ДНК
в агарозном геле 41
4.2.4 Выделение и очистка амплификатов
из агарозного геля 42
4.2.5 Полимеразная цепная реакция 42
4.2.6 Электрофоретическое разделение продуктов
амплификации в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) 43
4.2.7 Окрашивание гелей 44
4.2.7.1 Окрашивание бромистым этидием 44
4.2.7.2 Окрашивание ПААГ нитратом серебра 44
4.2.8 Анализ конформационного полиморфизма
одноцепочечной ДНК (SSCP) 45
4.2.9 Анализ полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов 46
5 Результаты и обсуждение 47
5.1 Результаты 47
5.2 Обсуждение полученных результатов 57
6 Выводы 59
Список использованных источников 60
Приложение А. Охрана труда и окружающей среды 67
Приложение Б. Оценка технико-экономических
результатов исследования 79

Работа выполнена согласно требований ГОСТ. Сдана на отлично. Уровень оригинальности текста на антиплагиат.ру составил 83

1 Carrell R.W. Conformational disease/ R.W. Carrell, D.A. Lomas// Lancet. – 1997. – V. 350. – P. 134-138.
2 Benson M.D. Aging, amyloid and cardiomyopathy/ M.D. Benson// New Eng. J. Med. – 1997. V. 336. – P. 502-504.
3 Buxbaum J.N. Transthyretin: the servant of many masters/ J.N. Buxbaum, N. Reixach// Cell. Mut. Life Sci. – 2009. – V. 66. – P. 3095–3101.
4 Kelly J.W. A chemical approach to elucidate the mechanism of transthyretin and protein amyloid fibril formation/ J.W. Kelly, P.T. Lansbury// Amyloid – 1994. – V. 1. – P. 186-205.
5 Sasaki H. Structure of the chromosomal gene for human serum prealbumin/ H. Sasaki, N. Yoshioka, Y. Takagi, Y. Sasaki// Gene. – 1985. – V. 253, №37. – P. 191-197.
6 Wilce J. A. Synthesis of an analog of the thyroid hormone-binding protein transthyretin via regioselective chemical ligation/ J. A. Wilce, S.G. Love, S.J. Richardson, P.F. Alewood, and D.J. Craik // Journal of Biological Chemistry. – 2001. – V. 276. – P. 25997-26003.
7 Биохимия: учебник для вузов/ под ред. Е.С. Северина. – М.: Мир, 2003. – 779 с.
8 Saraiva M.J.M. Transthyretin mutations in hyperthyroxinemia and amyloid diseases/ M.J. Saraiva// Hum. Mutat. – 2001. – V. 17, №6 – P. 493-503.
9 Hamilton J.A.The x-ray crystal structure refinements of normal human transthyretin and the amyloidogenic Val-30-->Met variant to 1.7-A resolution/ J.A. Hamilton, L.K. Steinrauf, B.C. Braden, J. Liepnieks, M.D. Benson, G. Holmgren, O. Sandgren, L.Steen // J. Biol. Chem. – 1993. – V. 268. – P. 2416-2424.
10 Herbert J. Transthyretin: a choroid plexus-specific transport protein in human brain/ J. Herbert, J.N. Wilcox, K.T.C. Pham, R.T.Jr. Fremeau, M. Zeviani, A. Dwork, D.R. Soprano, A. Makover, D.S. Goodman, E.A. Zimmerman, J.L. Roberts, E.A. Schon// Neurology. – 1986. – V.36. – P. 900—911.
11 Reiber H. Dynamics of brain-derived proteins in cerebrospinal fluid/ H. Reiber// Clinica Chimica Acta. – 2001. – V. 310. – P. 173—186.
12 Vatassery G. T. A sensitive assay of transthyretin (prealbumin) in human cerebrospinal fluid in nanogram amounts dy ELISA/ G. T. Vatassery, H.T. Quach, W.E. Smith, B.A. Benson and J.H. Eckfeldt// Clinica Chimica Acta. – 1991. – V. 197. – P. 19—25.
13 Episkopou V. Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone/ V. Episkopou, S. Maeda, S. Nishiguchi, K. Shimada, G.A. Gaitanaris, M.E. Gottesman, E.J. Robertson// Proc. Nat. Acad. Sci. – 1993. – V. 90. – P. 2375-2379.
14 Физиология человека. – М.: Медицина, 2003. – 656 с.
15 Schwarzman A.L. Transthyretin sequesters amyloid b protein and prevents amyloid formation/ A.L. Schwarzman, L. Gregori, M.P. Vitek, S. Lyubski, W.J. Strittmatter, J.J. Enghild, R. Bhasin, J. Silverman, K.H. Weisgraber, P.K. Coyle, M.G. Zagorski, J. Talafous, M. Eizenberg, A.M. Saunders, A.D. Roses, D. Goldgaber/ Proc. Natl. Acad. Sci. – 1994. – V. 9. – P. 8368-8372.
16 Saraiva M.J. Amyloid fibril protein in familial amyloidotic polyneuropathy, Portuguese type. Definition of molecular abnormality in transthyretin (prealbumin)/ M.J. Saraiva, S. Birken, P.P. Costa, D.S. Goodman// The Journal of clinical investigation. – 1984. – V. 74. – P. 104-119.
17 Soares M. L. Susceptibility and modifier genes in Portuguese transthyretin V30M amyloid polyneuropathy: complexity in a single-gene disease/ M. L. Soares, T. Coelho, A. Sousa, S. Batalov, I. Conceicao, M.L. Sales-Luis, M. D. Ritchie, S.M. Williams, C.M. Nievergelt, N.J. Schork, M.J. Saraiva, J.N. Buxbaum// Hum. Molec. Genet. – 2005. – V. 14. – P. 543-553.
18 Kelly J.W. Alternative conformations of amyloidogenic proteins govern their behavior/ J.W. Kelly// Curr. Opin. Struct. Biol. – 996. V. 6. P. 11-17.
19 Blake C. C. F. Structure of prealbumin: secondary, tertiary and quaternary interactions determined by Fourier refinement at 1.8A/ C.C.F. Blake, M. J. Geisow, S. J. Oatley, B. Rerat, and C. Rerat. // J. Mol. Biol. – 1978. – №121. – P. 339-356.
20 Lashuel H.A. The most pathogenic transthyretin variant, L55P, forms amyloid fibrils under acidic conditions and protofilaments under physiological conditions/ H.A. Lashuel, C. Wurth, L. Woo, J.W. Kelly// Biochemistry. – 1999. – V. 38. – P. 13650-13573.
21 Шавловский М.М. Молекулярные и генетические основы этиопатогенеза амилоидозов/ М.М. Шавловский// Мед. акад. Журнал. – 2010. – № 4. – с. 63-81.
22 Sekijima. Y. Familial Transthyretin Amyloidosis/ Y. Sekijima, K. Yoshida, T. Tokuda, S. Ikeda// GeneReviews[http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. – 2001.
23 Hellman U. Heterogeneity of penetrance in familial amyloid polyneuropathy, ATTR Val30Met, in the Swedish population/ U. Hellman, F. Alarcon, H.E. Lundgren et al.// Amyloid. – 2008. – №15. – P. 181-186.
24 Tan S.Y. Amyloidosis/ S.Y. Tan, M.B. Perys// Histopathology. – 1994. – V. 25. – P. 403-414.
25 Benson, M. D. Inherited amyloidosis/ M.D. Benson// J. Med. Genet. – 1991. – V. 28. – P. 73-78.
26 Carrell R.W. Conformational disease/ R.W. Carrell, D.A. Lomas// Lancet. – 1997. – V. 350. – P. 134-138.
27 Buxbaum J.N. Animal models of human amyloidoses: Are transgenic mice worth the time and trouble?/ J.N. Buxbaum// FEBS Letters. – 2009. – V. 583. – P. 2663-2673.
28 Merlini G. Molecular mechanisms of amyloidosis/ G. Merlini, V. Bellotti// N. Engl. J. Med. – 2003. – V. 349. – P. 583-596.
29 Massimo Stefani. Protein folding and misfolding on surfaces/ S. Massimo// Int. J. Mol. Sci. – 2008. – V. 9. – P. 2515-2542.
30 Sunde M. Structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction/ M. Sunde, C.C. Blake// Adv. Protein Chem. – 1997. – V. 50. – P. 123-159.
31 Kyle R.A. Amyloidosis (AL). Clinical and lab features of 224 cases/ R.A. Kyle, P.R. Greipp// MayoClin. Proc. –1983. – V. 58. – P. 665–683.
32 Uversky V.N. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded/ V.N. Uversky, A.L. Fink// Biochim. Biophys. Acta. – 2004. – V. 1698. – P. 131-153.
33 Kishimoto A. β-Helix is a likely core structure of yeast prion Sup35 amyloid fibres/ A. Kishimoto, K. Hasegawa, H. Suzuki, H. Taguchi, K. Namba, and M. Yoshida// Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2004. – V. 315. P. 739-745.
34 Falk R. The systemic amyloidosis: an overview. Advances in internal medicine/ R. Falk, M. Skinner// 2000. Chapter 4.
35 Husby G. Amyloidosis. Seminars in Arthritis and Rheumatism/ G. Husby// 1992. – V. 22. – P. 67-82.
36 Friedhoff P. A nucleated assembly mechanism of Alzheimer paired helical filaments/ P. Friedhoff, M. von Bergen, E.M.Mandelkow, P. Davies// Proc. Natl. Acad. Sci. – 1998. – V. 95. – P. 15712-15717.
37 Buxbaum J.N. The genetics of the amyloidoses/ J.N. Buxbaum, C.E. Tagoe// Annu. Rev. Med. – 2000. – V. 51. – P. 543-569.
38 Westermark, P. Fibril in senile systemic amyloidosis is derived from normal transthyretin/ P.Westermark, K. Sletten, B. Johansson, G.G. Cornwell// Proc. Nat. Acad. Sci. – 1990. – V. 87. – P. 2843-2845.
39 Кузнецов Г. П. Кардиомиопатии/ Г.П. Кузнецов. — Самара: Медицина, 2005. — 138 с.
40 Maron B.J. Contemporary Definitions and Classification of the Cardiomyopathies: An American Heart Association Scientific Statement From the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention/ B.J. Maron, J. A. Towbin, G. Thiene, C. Antzelevitch et al.// Circulation − 2006. — № 113. — Р. 1807—1816.
41 Levitas A. Familial neonatal isolated cardiomyopathy caused by a mutation in the flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase/ A. Levitas, E. Muhammad, G. Harel, A. Saada, V.C. Caspi, E. Manor, J.C. Beck, V. Sheffield, R. Parvari// Europ. J. Hum. Genet. – 2010. – V. 18. – P. 1160-1165.
42 Teare D. Asymmetrical hypertrophy of the heart in young adults/ D. Teare// Brit. Heart J. – 1985. – V. 20. – P. 1-8.
43 Saravia M.J. Тransthyretin mutations in health and disease/ M.J. Saravia // Hum. Mutat. – 1995. – V. 5. – P. 191-196.
44 Молекулярная биотехнология. Принципы и применение/ Б. Глик, Дж. Пастернак. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
45 Hayashi K. PCR-SSCP: a method for detektion of mutations/ Hayashi/ K. Hayashi// Genet.Anal.Tech.Appl. – 1993. – V. 9. – P. 73-79.
46 Orita M. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism/ M. Orita, H. Ivahana, H. Kanazawa, T. Sekya// Proc. Natl. Acad. Sci. – 1989. – Vol.86. – P.2766-2770.
47 Glavac D. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations/ D. Glavac, M. Dean// Hum. Mutat. – 1993. – Vol.2, №5. – P. 404-414.
48 Venter J. The sequence of the human genome/ J. Venter et al.// Science. - 2001. – V. 291, № 5507. – P. 1304-51.
49 Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы/ Л.И. Патрушев. — М.: Наука, 2005. — в 2 т.
50 Saiki R. R. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase/ R.R. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H.A. Erlich // Science. – 1988. – V. 239. – P. 487—491.
51 Erlich H.A. PCR Technology: Principles and applications for DNA amplification/ H.A. Erlich// Stockton Press. – 1989.
52 Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование/ Л.А. Остерман. – М.: Наука, 1981.
53 Kunkel L.M. Analyses of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants/ L.M. Kunkel, K.D. Smith, S.H. Boyer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1977. – V. 74. – P. 1245–1249.
54 Соловьев К.В. Мутации V30M, G47A, Y90N и del9 в гене транстиретина у больных кардиомиопатиями в Санкт-Петербурге/ К.В. Соловьев, Н.А. Грудинина и др.// Генетика. – 2011. – Т. 47, №2. – с.1-7.
55 Pankuweit S. Classification of cardiomyopathies and indication for endomyocardial biopsy revisited/ S. Pankuweit, A. Richter, V. Ruppert, B. Maisch// Herz. – 2009. – V. 34, №1. – P. 55–62.
56 Andrade C. A peculiar form of peripheral neuropathy: familial atypical generalised amyloidosis with special involvement of peripheral nerves/ C. Andrade// Brain. – 1952. – V. 75. – P. 408–427.
57 Scriver C. R. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease/ C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle// McGraw-Hill 8th. – 2001. – V. 8. – P. 5345-5378.
58 Benson M.D. Characterization of an amyloid fibril protein in heredofamilial amyloidosis/ M.D. Benson// Clin. Res. – 1980. – V. 28. – P. 340.
59 Holmgren G. Homozygosity for the transthyretin met(30) gene in two Swedish sibs with familial amyloidotic polyneuropathy/ G. Holmgren, E. Haettner, I. Nordenson et al. // Clin. Genet. – 1988. – V. 34. – P. 333–338.
60 Bartolini M. Strategies for the Inhibition of Protein Aggregation in Human Diseases/ M. Bartolini, V. Andrisano// ChemBioChem. – 2010. – Vol.11 – P.1-19
61 ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.
62 Кирюшкин А.А. охрана труда и окружающей среды: метод. указания к дипломному проектированию/ А.А. Кирюшкин, З.В. Капитоненко, Г.К. Ивахнюк. – СПб.: СПбГТИ(ТУ), 2005. – 27 с.
63 Вредные вещества в промышленности: в 3-х т. / Под ред. Н.В. Лазарева. – М.: Химия, 1976 – 1977. – 3 т.
64 Пожаровзрывоопасность веществ и материалов и средства их тушения: справочник в 2-х частях / под ред. А.Я. Корольченко. - М.: Пожнаука, 2000. - Ч.1 - 709 с.; Ч.2 - 757 с.
65 НПБ 105-03. Определение категорий помещений, зданий и наружных установок по взрывопожарной и пожарной опасности.
66 Правила устройства электроустановок. – М.: Главгосэнергонадзор России, 1998. – 607 с.
67 Правила защиты от статического электричества в производствах химической, нефтехимической и нефтеперерабатывающей промышленности. – М.: Химия, 1997.
68 СНиП 23-05-95. Естественное и искусственное освещение производственных помещений. Нормы проектирования.
69 Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде: справочник/ Г.П. Беспамятов, Ю.А. Кротов. – Л.: Химия, 1985. – 528 с.
70 Кочеров Н.П. Технико-экономическое обоснование инженерных решений при проектировании химических производств: метод. указания по разработке курсового проекта/ Н.П. Кочеров. – СПб.: СПбГТИ(ТУ), 2009. – 45 с.