Ti-плазмиды в генетической инженерий растений.

Содержание
Введение....................................................................................................3
1 Применеие Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии.4
1.1 Характеристика Agrobacterium tumefaciens.....................................4
1.2 Cоздание векторов на основе Ti-плазмид.....................................6
1.3 Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений.............................................................................................................7
1.4 Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens.................................................................................12
1.5 Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение...........................................................................................................15
1.6 Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях.........................................................................................................16
2. Практическое применение генетической инженерии растений с использованием Ti-плазмид...........................................................................18
2.1 Краткая характеристика..............................................................18
2.2 Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК.................................................................................................................22
3 Материалы и методы...................................................................23
3.1 Материалы...................................................................................23
3.2 Методы..........................................................................................26
Вывод.....................................................................................................28
Список литературы...............................................................................30

Введение

Актуальность работы. Свойство бактерии вида Agrobacterium tumefaciens порождать у растений корончато-галловую болезнь связывают с нахождением в их клетке крупной (96-157 мДа) конъюгированной Ti-плазмиды. В ходе идентифицирования растения небольшая часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК переходит в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, при этом она остаётся частью родового материала. Ген тДНК экспрессируется в трансформарованной растительной клетке, нарушает её фитогормональный баланс и определяет синтез специфического соединения.
Агробактерии – это природный "генный инженер", который осуществляет удивительный, по филогенетической дальности, переход генетической информации. На основе агробактерий сконструирована эффективная векторная система для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация совершается в итоге сложнейшего процесса взаимосвязи между бактериальной и растительной клеткой.
...

1.1 Характеристика Agrobacterium tumefaciens
В последнее время в генетической инженерии растений был достигнут большой успех. Был разработан метод генетической трансформации и, в наше время была реализована экспрессия чужеродного гене в растении разного вида. Самым важным для формирования генетической инженерии растений является открытие молекулярной основы опухолевого образования при помощи Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентный штамм Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуется наличием в клетке значительной плазмиды, Ti-плазмиды, с весом больше 140 т.п.н. [9].
Агробактерия вызывает рост опухоли у многих растений [2,3]. Для инфицирования in vivo нужно повредить ткань растения [12].
После того как к клеточной стенке прикрепляют растительную клетку, агробактерия переносит часть Ti-плазмиды в ядро, там случается ее устойчивая интеграция в хромосомы растений.
...

1.3 Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений
При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механическим поврежденной частью растения, регенерирующей протопластом или в наличии из клетки бактерии можно определить разную молекулярную форму процессированной тДНК – одноцепочечную линейную, двуцепочечную линейную и двуцепочечную кольцевую, которая может быть посредником переноса генетических материалов в растительные клетки. При этом кольцевые формы, которые образуются за счет гомологичных рекомбинаций между правыми и левыми границами тДНК с созданием одной гибридной границы, встречаются очень редко. При их создании не произойдет репликативный синтез ДНК, в то время как в случае создания 2-х других форм, прохождение репликации тДНК в бактериях возможно, в ходе ее транспорта в растения.
...

1.4 Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens
Много из первых экспериментов по генетическим трансформациям растения было предпринято при помощи задержки пораненной растительной клетки с использованием агробактери с немодифицированной Ti-плазмидой. Для того, что бы сохранить стерильность, часто инфицировали эксплантат in vitro за место целого растения. Бактерии после этого, подлежали удалению, прибавляли в среду цефотоксин или карбенициллин. Трансформант выбирали на безгормональных средах.
По ходу образования обезоруженного вектора и новой селективной маркеровки, разработали более действенный метод, который дает больше числа трансформантов: кокультивирование агробактерии с растительным протопластом либо с эксплантантом листа. Было изображено, что кокультивирование протопласта с агробактерией, либо с бактериальной, влечет образование опухоли.
...

1.5 Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение
Чужеродные ДНК, которые переместились в растительную клетку при помощи разных способов, обычно входят в ядерный геном и идут в наследстве по закону Менделя. Область интеграции, по-видимому, распределена случайным образом по геному. Встраивание гена по определенному сайту было раньше показано в системе животной клетки и не так давно такой подход успешно применили для трансформации растения.
Во множестве случаев последовательность чужеродной ДНК встраивается в один локус, или в одну копию, или в образе кластера тандемной вставки, что было изучено при помощи гибридизации in situ Часто просматриваются множество вставок в 2 или больше участков на разной хромосоме. В связи с этим во многих экспериментах получили контрансформацию физически несцепленного гена.
Чужеродный ген обычно передаётся потомству с большой стабильности при мейозе. Но, порой наблюдается случайная потеря трансформированных фенотипов после мейоза.
...

1.6 Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях
Для анализа экспрессии чужеродного гена в растении применяют много методов, в том числе Нозери-анализ РНК и Вестери-анализ продукта трансдукции. Кроме того, необходимо изучение фенотипических. Для того, что бы проанализировать экспрессию такого репортернного гена, как cat, npt II, ген октопин, и разработана чувствительная методика.
Этот анализ имеет огромное значение, так как возможна комбинация кодирующих последовательностей репортернного гена с имеющимися регуляторными последовательностями растительного гена, либо создания двойного гена, экспрессирующегося с одного и того же промотора. Активность генов и промотора можно найти или при помощи ферментативных анализов, либо гибридизации растительных РНК с зондом, комплементарным репортерным генам.
...

2.1 Краткая характеристика
Несколько лет назад ученые задавались вопросом, можно ли создать сорт, сбалансированный по составу аминокислоты, устойчивый к морозу, засухе, не поражаемый вредителям. На сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что такие трансгенные растения уже появились в полях. После удачного эксперимента появляются опасения о возможных негативных последствиях генетической инженерии на природу и человека. Однако уже более чем за 25 лет своего существования генетическая инженерия не приносит ущерб ни природе, ни людям. Главное, в любом эксперименте по генной инженерии необходимо соблюдение разработанных правил. Очень остро поставили вопросы о приобретении растения, устойчивого к вредителю продуктов сельского хозяйства, так как болезнь растения стала основным лимитирующим фактором для сбора урожая. В запасе генной инженерии растений имеется множество приемов, которые позволяют получать трансгенных растений, устойчивых к насекомому.
...

2.2 Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК
Экспрессия генов vir-области индуцируется специфическими сигнальными молекулами через позитивную регуляцию системы в составе которой имеются гены virA и virG.
Активатором транскрипции vir-гена является низкомолекулярное моноциклическое фенольное соединение, синтезируемое в механически поврежденной ткани растения.
Сигнальная молекула была впервые обнаружена в экссудатах корня и листа двудольного растения Nicotiano tabacum, она была идентифицирована. Это соединение синтезировало метаболически активную поврежденную ткань растения. В наше время установили сигнальную индуцирующую активность у большого числа групп соединений растительной природы. Механические повреждения ткани растения приводят к увеличению синтеза такого сигнального соединения. Для наилучшей индукции экспрессии гена vir необхожимо наличие в эксцудате растения разных видов углеводов.
...

1. Анализ генома. Методы. Под ред. Н. Дейвиса. – М.: Мир, 1990. – 247 с.
2. Великов В.А., Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Генетика.1998. №8. т. 34. с. 1056-1062.
3. Великов В.А., Бурьянов Я.И. Изучение конъюгационного транспорта Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Тезисы докладов III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г, с. 49.
4. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. – М.: Мир, 1991. – 408 с.
5. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. – М.: Мир, 1988. – 538 с.
6. Малиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. – М.:Мир, 1984. – 463 с.
7. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред. А.И. . – Новосибирск: Наука, 1990. – 248 с.
8. Мобильность генома растений. Под ред. Б. Хол и Е.С. Делинс. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
9. Плазмиды. Методы. Под ред. Д. Хорда. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
10. Пехов А.П. Основы плазмидологии.- М.: 1996. – 231 с.
11. Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Р.Л. Подреперс и Д.Т. Денхардт. – М.: Агропромиздат, 1991. – 535 с.
12. Солова Г.К., Кривопалов Ю.В., Великов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium к корням пшеницы. // Микробиология. 1995. т. 64. №4, с. 526-530.
13. Захарченко Н.С., Комиви М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга тДНК. // Физиология растений. 1999. т. 46. № 2, - с. 282-291.
14. Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335-350.
15. Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp. 850-860.
16. Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL – DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38.
17. Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119.
18. Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350.
19. Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170.
20. Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454.
21. Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150.